Phương pháp ELISA là một quy trình quan trọng giúp xác định lượng mục tiêu có trong mẫu. Việc chuẩn bị mẫu đúng cách là điều rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả của xét nghiệm ELISA.
Sau khi chuẩn bị mẫu, chúng có thể được chia aliquot và đông lạnh để lưu trữ dài hạn. Điều kiện lưu trữ được khuyến nghị là: 2-8°C trong 5 ngày, -20°C trong 6 tháng và -80°C trong 2 năm. Nên tránh lặp lại các chu kỳ đông lạnh-rã đông khi lấy mẫu từ kho, vì vậy việc lưu trữ mẫu trong các aliquot nhỏ là tốt hơn.
Có nhiều loại mẫu khác nhau có thể sử dụng cho phương pháp ELISA. Sau đây sẽ là các loại mẫu phổ biến và hướng dẫn chung về cách chuẩn bị từng loại mẫu. Tuy nhiên, chúng tôi khuyến nghị tuân theo các hướng dẫn cụ thể đi kèm với mỗi bộ kit, vì có thể có sự khác biệt nhỏ trong quy trình từ bộ kit này sang bộ kit khác.
Các loại mẫu khác nhau
Mẫu máu
Huyết thanh: Không chứa tế bào máu hay yếu tố đông máu; tương tự như huyết tương nhưng không có fibrinogen.
(a) Để mẫu máu tĩnh tại trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 2-8°C để huyết thanh hóa. Đây là phương pháp đông máu tự nhiên. Quá trình này sẽ chậm lại nếu nhiệt độ giảm.
(b) Tiến hành ly tâm mẫu trong 20 phút với tốc độ 1000 x g.
(c) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(d) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Huyết tương (EDTA, Citric Acid, Heparin): Các mẫu này cần chất chống đông, tùy thuộc vào phân tích mục tiêu sử dụng.
(a) Thu thập huyết tương vào ống có chất chống đông cần thiết và trộn nhẹ.
(b) Tiến hành ly tâm trong 15 phút với tốc độ 1000 x g ở 2-8°C trong vòng 30 phút từ khi thu thập mẫu.
(c) Chuyển phần huyết tương vào ống sạch.
(d) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu mô
Hầu hết các mẫu mô đều phải được xử lý thành hỗn hợp mô. Quy trình sử dụng sẽ phụ thuộc vào loại mô được chiết xuất làm mẫu. Có thể cần thêm chất ức chế protein để giảm thiểu hoặc ngừng sự phân hủy của analyte.
(a) Mô phải được mổ xẻ bằng dụng cụ sạch, sau đó nhanh chóng đặt lên đá để ngăn ngừa sự phân hủy của proteinase.
(b) Rửa mô bằng dung dịch PBS 0.01M (pH 7.4) đã làm lạnh trước, để loại bỏ máu còn sót lại.
(c) Cân mô trước khi đồng nhất hóa.
(d) Ly tâm hỗn hợp đồng nhất trong 5 phút với tốc độ 5000 x g.
(e) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(f) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu tế bào
Dịch chiết tế bào: Các tế bào cần được phá vỡ (lysis) để có thể sử dụng trong phân tích ELISA. Quá trình ly giải có thể sử dụng hóa chất (ví dụ Triton X-100, sodium deoxycholate, RIPA, SDS, DTT, ure) hoặc phương pháp vật lý như chu kỳ đông lạnh-rã đông hoặc siêu âm.
(a) Các tế bào bám dính được tách ra thành huyền phù bằng dung dịch trypsin, sau đó ly tâm và thu phần huyết thanh vào ống sạch.
(b) Thêm PBS đã làm lạnh và rửa ba lần.
(c) Tế bào sau đó được ly giải bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý. Ví dụ: thêm 0.5ml dung dịch đệm RIPA và siêu âm 4 lần hoặc đông lạnh-rã đông 4 lần.
(d) Ly tâm ở tốc độ 1500 x g trong 10 phút để loại bỏ các tạp chất tế bào.
(e) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(f) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu nước bọt, sữa và nước tiểu
Các mẫu này ngày càng phổ biến vì chúng có quy trình thu thập ít xâm lấn hơn so với mẫu máu. Chúng thường được sử dụng để phát hiện các tác nhân kháng khuẩn, analyte đã được tiết ra và nhiều enzyme sinh học khác.
(a) Thu thập mẫu vào ống ly tâm vô trùng.
(b) Ly tâm với tốc độ 10,000 x g trong 2 phút ở 2-8°C hoặc với tốc độ 2000-3000 rpm trong 20 phút.
(c) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(d) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu đờm
Đờm là sự kết hợp giữa dịch nhầy và nước bọt, chủ yếu có trong đường hô hấp. Đờm thường được tống ra ngoài qua ho. Có nhiều vi khuẩn gây bệnh có thể có trong đờm.
(a) Cân phần đặc của đờm.
(b) Thêm dung dịch DTT 0.1% (có tác dụng làm tan đờm) vào đờm và trộn ở 35°C trong 5 phút.
(c) Thêm PBS vào hỗn hợp (pha loãng 1/2), tiếp tục trộn trong 15-20 phút.
(d) Lọc hỗn hợp qua lưới kim loại.
(e) Ly tâm ở tốc độ 1500 rpm trong 10 phút.
(f) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(g) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu dịch não tủy, dịch cổ trướng và dịch rửa phế quản phổi (BALF)
(a) Sau khi thu thập mẫu, ly tâm ở 12000 rpm trong 20 phút.
(b) Kiểm tra để đảm bảo không có kết tủa, cần ly tâm lại nếu có kết tủa.
(c) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(d) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu tinh dịch
(a) Thu thập mẫu tinh dịch vào container vô trùng.
(b) Đặt container vào bể nước ở nhiệt độ phòng hoặc 37°C. Điều này sẽ giúp các enzyme fibrinolytic làm loãng và làm lỏng tinh dịch.
(c) Ly tâm tinh dịch lỏng trong 10 phút ở 4000 rpm để tách plasma tinh dịch.
(d) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(e) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
Mẫu phân
(a) Thu thập mẫu phân khô hơn 50mg. Lưu ý rằng các mẫu phân pha loãng khó xử lý và khó phát hiện hơn vì độ chính xác giảm.
(b) Rửa mẫu phân ba lần bằng PBS.
(c) Sau bước ly tâm, hòa lại với PBS (tỷ lệ 1g phân/9ml PBS). Có thể dùng siêu âm để nghiền dung dịch.
(d) Ly tâm ở tốc độ 5000 x g trong 10 phút.
(e) Chuyển phần huyết thanh vào ống sạch.
(f) Có thể phân tích ngay lập tức hoặc đông lạnh (-20°C hoặc -80°C) để sử dụng sau.
