ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật miễn dịch học dùng để phát hiện hoặc định lượng nồng độ của chất phân tích cụ thể. Định dạng tiêu chuẩn của xét nghiệm ELISA là đĩa vi chuẩn 96 giếng (8 hàng x 12 cột), trong đó:
Chuẩn bị giếng: Mỗi giếng được xử lý trước để tạo điều kiện xảy ra phản ứng, thường bao gồm sự thay đổi màu sắc của dung dịch trong giếng.
Phát hiện tín hiệu: Màu dung dịch chuyển từ trong suốt (không có phản ứng) sang xanh đậm (phản ứng 100%). Cường độ màu được đo bằng máy quang phổ (spectrophotometer) để ghi lại mật độ quang học (OD).
Định lượng: Nồng độ chất phân tích chưa biết được so sánh với đường chuẩn, được xây dựng từ các dung dịch chuẩn có nồng độ đã biết.
Các loại đầu ra dữ liệu ELISA
ELISA định tính (Qualitative ELISA)
Cung cấp kết quả dương tính hoặc âm tính.
Xác định sự hiện diện của kháng nguyên bằng cách so sánh với giếng trống hoặc kháng nguyên không liên quan.
ELISA bán định lượng (Semi-Quantitative ELISA)
So sánh lượng tương đối của kháng nguyên có trong mẫu.
Tín hiệu phát hiện tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên, nhưng không thể tính toán nồng độ chính xác do không có protein chuẩn trong bộ kit.
ELISA định lượng (Quantitative ELISA)
Tính toán chính xác nồng độ kháng nguyên trong mẫu.
Xây dựng đường chuẩn bằng cách pha loãng nối tiếp protein chuẩn có nồng độ đã biết.
Nồng độ chưa biết được nội suy từ đường chuẩn.
Đường chuẩn ELISA
Xây dựng đường chuẩn: Dùng các nồng độ kháng nguyên chuẩn để vẽ đồ thị nồng độ (trục X) và mật độ quang học (OD, trục Y) đo tại bước sóng 450nm bằng máy đọc đĩa.
Phân tích dữ liệu: Hầu hết các máy đọc đĩa đều có phần mềm tích hợp để tự động hóa quá trình phân tích dữ liệu và tạo đường cong. Kết quả kháng nguyên chưa biết được tính toán bằng cách nội suy từ phần tuyến tính của đường chuẩn.
Thực hành tốt khi chạy ELISA
Lặp lại mẫu: Chạy mẫu ít nhất hai hoặc ba lần (duplicate/triplicate) để đảm bảo độ chính xác.
Kiểm tra sai số: Tính độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV). CV nên giữ dưới 20% để đạt độ tin cậy cao.
Kiểm soát nội bộ: Bao gồm mẫu dương tính (có chứa kháng nguyên mục tiêu) và mẫu âm tính (không chứa kháng nguyên).
Các kiểu đồ thị đường chuẩn
Đồ thị bán log (Semi-log plot)
Sử dụng log của nồng độ kháng nguyên để chống lại OD.
Tạo đường cong hình chữ S, phù hợp cho phân bố dữ liệu đều hơn.
Đồ thị tuyến tính (Linear plot)
Vẽ đường cong với nồng độ kháng nguyên (trục X) và OD (trục Y).
Đường tuyến tính tốt có R2>0.99R^2 > 0.99R2>0.99. Tuy nhiên, nén dữ liệu ở nồng độ thấp là nhược điểm.
Đồ thị log-log
Tốt cho phạm vi nồng độ thấp đến trung bình, đảm bảo tính tuyến tính cao trong phạm vi này.
Tuy nhiên, mất tuyến tính ở nồng độ cao.
Đường cong 4 hoặc 5 tham số (4PL/5PL)
Sử dụng phương pháp logistic 4 hoặc 5 tham số.
Phương pháp 5PL được ưa chuộng hơn nhờ khả năng mô phỏng tính bất đối xứng, phù hợp cho các xét nghiệm miễn dịch.
Spike recovery (Phục hồi mẫu tăng cường)
Mục đích: Xác định xem có thành phần nào trong mẫu cản trở quá trình liên kết kháng thể-kháng nguyên hay không.
Thực hiện: Bổ sung protein tái tổ hợp có nồng độ đã biết vào mẫu, sau đó tiến hành xét nghiệm ELISA tiêu chuẩn.
Kết quả:
Phục hồi dưới 80%: Có sự cản trở, cần chuyển sang bộ kit ELISA khác.
Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation - CV)
Tầm quan trọng: Đánh giá mức độ không chính xác hoặc không nhất quán của dữ liệu.
Nguyên nhân gây CV cao:
Nhiễm bẩn mẫu.
Biến đổi nhiệt độ.
Lỗi thao tác pipet.
Rửa không đủ hoặc giếng bị khô.
Giảm CV: Sử dụng kỹ thuật pipet chính xác, đảm bảo quy trình rửa tốt và bảo quản mẫu đúng cách.
Phương pháp ELISA không chỉ là công cụ chẩn đoán đáng tin cậy mà còn giúp phát triển nghiên cứu khoa học, tạo nền tảng cho các tiến bộ trong y học và công nghệ sinh học.
